刚地弓形虫自噬相关蛋白3基因的克隆表达与多抗制备

科研成果详情

题名	刚地弓形虫自噬相关蛋白3基因的克隆表达与多抗制备
其他题名	Cloning and Expression of Toxoplasma gondii Autophagy-related Protein 3 Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibody
作者	华倩倩 1; 李相志 2; 万玉静 2; 陈弟 3; 赵徐寒晖 3; 蒋凯3; 胡昕4; 潘长旺2; 谭峰2
发表日期	2014-12-30
发表期刊	中国寄生虫学与寄生虫病杂志影响因子和分区
语种	中文
原始文献类型	学术期刊
关键词	刚地弓形虫自噬相关蛋白3 克隆表达多克隆抗体
其他关键词	Toxoplasma gondii ; Autophagy-related protein 3 ; Clone ; Expression ; Polyclonal antibody
摘要	目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)自噬相关蛋白3(Tg Atg3)基因,并制备能特异性识别该蛋白的多克隆抗体。方法以弓形虫RH株c DNA为模板,构建p ET28a-Tg Atg3重组质粒,转化入大肠埃希菌(E.coli)Rosetta感受态细胞,经自诱导培养基诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的Tg Atg3蛋白作为抗原皮下多点注射免疫日本大耳白兔,125μg/(只·次),免疫4次后心脏取血,制备血清,获得特异性抗Tg Atg3多克隆抗体。对制备的多克隆抗体进行Western blotting与间接免疫荧光法(IFA)鉴定。结果双酶切、PCR扩增及测序结果证实目的片段序列正确,原核表达质粒p ET28a-Tg Atg3构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组E.coli中可见相对分子质量(Mr)约44 000的可溶性Tg Atg3蛋白的高效表达。抗体检测Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的Tg Atg3蛋白。IFA结果显示,该多克隆抗体可与虫体胞浆内Tg Atg3结合。结论获得重组可溶性Tg Atg3蛋白,制备的多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的天然Atg3蛋白。
其他摘要	Objective To clone and express autophagy-related protein 3(TgAtg3)gene of Toxoplasma gondii, and obtain the specific polyclonal antibody against TgAtg3. Methods TgAtg3 cDNA was inserted into prokaryotic expression vector pET28a. After identification, the constructed plasmid pET28a-TgAtg3 was transformed into E. coli Rosetta cells, and induced by special induction medium for expression of the protein. The recombinant protein was purified via Ni-NTA affinity chromatography. Western blotting assay was performed with anti-His tag mouse monoclonal antibody as the primary antibody. Rabbits were immunized with 125 μg purified TgAtg recombinant protein. Each rabbit received 4 immunizations at 2-week intervals with the same dose of antigen. The specific anti-TgAtg3 polyclonal antibody was obtained, and analyzed by Western blotting and indirect immunofluorescence assay(IFA). Results pET28a-TgAtg3 plasmid was identified by restriction enzyme digestion, PCR amplification and sequencing. SDS-PAGE and Western blotting analysis showed that the recombinant TgAtg3 protein(about M_r 44 000)was expressed in E. coli Rosetta cells. TgAtg3 protein from tachyzoite lysates was recognized by the specific anti-TgAtg3 polyclonal antibody. IFA assay determined that the specific polyclonal antibody bound to TgAtg3 protein from the cytoplasm of tachyzoites. Conclusion The obtained soluble polyclonal antibody against TgAtg3 can specifically react to the endogenous TgAtg3 protein.
资助项目	浙江省自然科学基金（No.LY12H19004,LQ14H190003）;浙江省科技厅公益性项目（No.2014C33161）;浙江省新苗人才计划（No.2014R413082）~~
ISSN	1000-7423
卷号	32 期号:06 页码:432-436
页数	5
收录类别	CNKI ; 万方 ; 北大核心 ; PKU ; CSCD ; ISTIC
学科领域	医药、卫生 ; 基础医学
URL	查看原文
CSCD记录号	CSCD:5340988
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文献类型	期刊论文
条目标识符	https://kms.wmu.edu.cn/handle/3ETUA0LF/50445
专题	基础医学院（机能实验教学中心）检验医学院（生命科学学院、生物学实验教学中心）第一临床医学院（信息与工程学院）、附属第一医院
作者单位	1.东阳市人民医院检验科; 2.温州医科大学基础医学院; 3.温州医科大学第一临床医学院; 4.温州医科大学生命科学学院检验医学院
推荐引用方式 GB/T 7714	华倩倩,李相志,万玉静,等. 刚地弓形虫自噬相关蛋白3基因的克隆表达与多抗制备[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2014,32(06):432-436.
APA	华倩倩., 李相志., 万玉静., 陈弟., 赵徐寒晖., ... & 谭峰. (2014). 刚地弓形虫自噬相关蛋白3基因的克隆表达与多抗制备. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 32(06), 432-436.
MLA	华倩倩,et al."刚地弓形虫自噬相关蛋白3基因的克隆表达与多抗制备".中国寄生虫学与寄生虫病杂志 32.06(2014):432-436.

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ZJSB201406009.CAJ（409KB）	期刊论文	出版稿	开放获取	CC BY-NC-SA	浏览下载